(Blood, 2009) pour mesurer la diversité moléculaire de plusieurs échantillons.En particulier, le séquençage a été réalisé sur un échantillon de PBMC issus d'un sujet sain et sur un échantillon de PBMC dans lequel un clone a été dilué (ce qui mime un échantillon issu d'un sujet atteint de leucémie T) ; les diversités combinatoires des deux échantillons ont ensuite été comparées avec celles obtenues par la technologie multi-N-plexe décrite plus haut.Le séquençage à haut débit (NGS) a été effectué selon le procédé suivant : Nat Methods, 3, 895-901.Bogue, M., Gilfillan, S., Benoist, C. and Mathis, D. (1992) Régulation of N-region diversity in antigen receptors through thymocyte differentiation and thymus ontogeny. Les conditions de PCR sont décrites dans l'article de Gilles Marodon et al. and Schatz, D.G. (1988) T-cell antigen receptor gènes and T-cell récognition. Ces données permettent d'évaluer l'aspect qualitatif du répertoire immunitaire et d'estimer le niveau de perturbation du répertoire suite à un traitement.Afin de déterminer le rôle des différents biomarqueurs du cancer dans la survie des patientes, un modèle d'estimation de la survie globale a été construit. Pour le cancer du sein localisé, le traitement a un objectif curatif. Published by Elsevier Masson SAS All rights reserved. Néanmoins, si le lymphocyte T se met à l'exprimer, le TCR est aussi sensible à cette enzyme que le BCR car il possède toutes les séquences sur laquelle elle agit. La figure 4C présente, toujours pour la même cohorte, les courbes de survie des patientes en fonction de leur état lymphopénique ou non (avec un seuil à 0,7 Giga/1). Le coût de l'analyse sera donc mis en balance avec le niveau d'information souhaité, selon les situations, pour déterminer un nombre optimum de réarrangements observables. Mol Immunol, 44, 3380-3388.Hamblin, T.J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D.G. 0829,Tableau 7 : analyse univariée de la diversité combinatoire (valeur quantitative et qualitative) en fonction de la survie globale.La diversité combinatoire de la chaîne IgH a, malgré les résultats de l'analyse univariée, été intégrée dans un modèle de prédiction multivarié simple (tableau 6) comme cela avait été réalisé pour l'étude du TCR (exemple 1). 0829.Kotani, A., Okazaki, I.M., Muramatsu, M, Kinoshita, K., Begum, N.A., Nakajima, T., Saito, H. and Honjo, T. (2005) A target sélection of somatic hypermutations is regulated similarly between T and B cells upon activation-induced cytidine deaminase expression. (Robins et al., 2009). Pour cela, le système immunitaire a Cet exemple montre que la diversité du répertoire immunitaire peut être mesurée par différentes technologies, en particulier par séquençage ; la diversité du répertoire immunitaire demeure, quelle que soit la technologie utilisée pour la mesurer, un marqueur pronostique pour les cancers solides (dès lors que cette mesure est suffisamment quantitative et qualitative).Pour la mise en œuvre de l'invention, l'ADN génomique est de préférence purifié. Le type de modèle statistique utilisé pour ce faire est le modèle de Cox. (2004).Exemple 2 : Etude de la corrélation entre un risque de décès précoce accru et une faible diversité combinatoire B, chez des patientes atteintes de cancer du sein métastatique.La diversité combinatoire des lymphocytes B a été étudiée en utilisant le test hlgH®.Une PCR Multiplexe IgH® est réalisée en utilisant un oligonucléotide "upstream" spécifique de tous les membres d'une famille V donnée et un oligonucléotide "downstream" spécifique d'une famille J donnée. Deux mécanismes contribuent à augmenter la diversité jonctionnelle : 1) le premier mécanisme est dû à l'ajout de nucléotides P (pour palindromiques), provenant de la résolution de l'épingle à cheveux des segments réarrangés (Fugmann et al., 2000). La transposition des résultats décrits dans la partie expérimentale ci- dessous, par des expérimentations et une analyse statistique de routine, permettra de déterminer un seuil significatif pour la technologie alternative utilisée.Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, illustré expérimentalement ci-dessous, la diversité est mesurée au niveau combinatoire. (1972) Régression model and life tables. En particulier, les inventeurs ont déterminé, dans le cas du cancer du sein métastatique, qu'une diversité combinatoire des réarrangements V(D)J des gènes du locus hTRB inférieure à 20% des réarrangements possibles est un facteur pronostic puissant de décès précoce, avec une médiane de survie inférieure à 6 mois. Par exemple, les brevets US 5,296,351 et US 5,418,134 présentent une méthode de détection des leucémies lymphoïdes ou des lymphomes B ou T, basée sur l' amplifications de séquences codant pour des immunoglobulines et/ou des récepteurs T, utilisant des amorces "consensus" pour amplifier simultanément plusieurs réarrangements V-J.Les inventeurs ont précédemment décrit des méthodes et kits pour mesurer la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T et/ou B d'un individu (WO 2009/095567). Ceci démontre clairement que la numération n'est pas systématiquement corrélée avec la diversité et la qualité du répertoire immunitaire.N.b. The integration of the uPA/PAI-1 prognostic information gathered in the multidisciplinary medical consensus meetings could be used to select the node-negative good/prognosis population in which chemotherapy could be avoided. En effet, si on examine le nombre de combinaisons primaires TCRyô chez la souris, sans prendre en compte la diversité jonctionnelle, le résultat est seulement de 40 TCRÔ (=10V*2D*2J) x 28 TCRy (=7V*4J) = 1 120 combinaisons différentes, alors que le même calcul conduit à 5,6 10.La diversité du répertoire des immunoglobulines produites par les lymphocytes B résulte des mêmes mécanismes que ceux décrits ci-dessus pour les lymphocytes T.La mesure de la diversité immunologique permet entre autres d'étudier les mécanismes de mise en place du répertoire immunitaire, l'homéostasie, les lymphocytes T ou B impliqués dans une réponse immunitaire, dans une leucémie ou encore d'évaluer l'immunodéficience induite par un traitement ou une pathologie, en particulier tumorale, ou à l'inverse l'activation du système immunitaire spécifique. J Roy Stat Soc, 34, 187-220.Davis, M.M. Le dosage des taux d’uPA et de PAI-1, au sein du tissu tumoral, fait partie des facteurs décisionnels les plus relevant dans cette situation. Utilisation d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, pour aider le clinicien à déterminer si un patient atteint d'un cancer solide doit bénéficier d'un suivi hospitalier particulier et/ou d'une antibiothérapie préventive et/ou d'une immunostimulation et/ou d'une vaccination et/ou d'une chimiothérapie et/ou d'un changement de posologie ou de fréquence d'administration d'une chimiothérapie, et/ou de compléments alimentaires visant à reconstituer ses défenses immunitaires.Utilisation de la diversite combinatoire du repertoire des lymphocytes t comme marqueur pronostic d'un cancer,Application filed by ImmunID, Centre Leon Berard,BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING,MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES,Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions,Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids,Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. La très haute densité de la puce (plus de 100 millions de molécules par centimètres carrés) permet de séquencer environ 100.000 paires de bases par seconde. J Am Stat Assoc, 53, 457-481. O Scribd é o maior site social de leitura e publicação do mundo. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle la mesure de la diversité combinatoire du répertoire des lymphocytes T dudit individu est effectuée par une méthode permettant d'analyser au moins 20 réarrangements V(D)J du locus TRA ou du locus TRB.7. Cette technologie permet la détection simultanée de plusieurs réarrangements V-J dans la même réaction. Quant aux gènes D, ils en possèdent aux deux extrémités. They are frequently associated with lacunae and with hyperintense (bright) signals in white matter. La construction du modèle est réalisée sur la base de la mise en présence de différents facteurs pronostiques déjà identifiés pouvant être protecteurs ou à risque de décès du cancer (ex : une faible concentration d'hémoglobine est à risque pour la patiente). (1999) Unmutated Ig V(H) gènes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Annu Rev Immunol, 18, 495-527.Fuschiotti, P., Pasqual, N., Hierle, V., Borel, E., London, J., Marche, P.N. Cette méthode est basée sur l'analyse ex vivo de la diversité lymphocytaire des patients, à partir d'un échantillon biologique contenant des lymphocytes. Par exemple, le Trastuzumab (Herceptin ®) cible le récepteur Her2 (ou CerbB2), qui est un récepteur membranaire permettant d'activer une des voies de la prolifération cellulaire, sur-exprimé dans 25% des cancers mammaires, souvent de mauvais pronostic. Le séquençage sur puce est fondé sur l'intégration de plusieurs techniques : les biopuces à ADN, la nanotechnologie, une variante de la technique de Sanger appelé CRT (cyclic réversible termination), ainsi que des technologies informatiques de pointe pour l'acquisition, le traitement et l'analyse des images. Blood, 114, 4099- 4107.Rothman, K.J. Numération normale (1000-3200Ly^L) et diversité normale.La figure 4A présente, pour la cohorte de 66 patientes étudiée aux exemples 1 et 2 ci-dessus (notée WPl a), un graphique NDL, dans lequel le seuil en- dessous duquel la diversité combinatoire est considérée comme faible a été fixé à 30%. Elle vise par ailleurs à identifier un groupe à risque (ne répondant vraisemblablement pas au traitement de référence) pour une pathologie tumorale donnée, afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et d'augmenter le rapport bénéfice/risque de candidats médicaments, favorisant ainsi leur approbation clinique.Les cancers solides désignent la multiplication anormale de cellules dans des tissus et/ou des organes "solides" comme le sein ou la prostate, par opposition à la leucémie, un cancer qui touche le sang et la moelle osseuse.Parmi les cancers solides, le cancer du sein est un des plus fréquents. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 4506-451 1.Marodon, G., Desjardins, D., Mercey, L., Baillou, C, Parent, P., Manuel, M., Caux, C, Bellier, B., Pasqual, N. and Klatzmann, D. (2009) High diversity of the immune répertoire in humanized NOD.SOD.gamma c-/- mice. En tout état de cause, il est préférable, pour obtenir un résultat exploitable, d'analyser au moins 10 réarrangements, de préférence au moins 20, ou 30, voire 50 réarrangements du locus TRA ou du locus TRB. Numération normale (1000-3200Ly^L) et diversité combinatoire faible.Zone 4. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material,Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle, à l'étape (i), l'acide nucléique utilisé est de l'ADN génomique.4. Ce marqueur est indépendant de la lymphopénie CD4+ (<450 +ΙμΥ) décrite par Borg C & al. Ces protéines sont les actrices principales du réarrangement. Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, illustrée dans l'exemple 1 sur une cohorte de patientes atteintes de cancer du sein métastatique, le seuil considéré à l'étape (ii) du procédé est fixé à 33% ou à 30% de diversité, et l'interprétation à l'étape (iii) consiste à dire que si le niveau de diversité combinatoire des lymphocytes T mesuré est inférieur à ce seuil, l'individu a une espérance de vie deux fois moindre que celle généralement observée pour sa pathologie. : Il est important de préciser que compte tenu du fait que la diversité immunitaire peut varier en fonction d'un traitement, ou d'une pathologie, la valeur pronostique du marqueur de divpénie n'est précise que pendant une certaine période de quelques jours à quelques mois (notion de durée de péremption de la prévision de risque infectieux). primers or probes,Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. La formation des ponts d'amplifications permet d'avoir une haute densité de brins d'ADN. 9.Etude des hypermutations somatiques (HMS) :- PCR / séquençage (Hamblin et al., 1999).Mesure indirecte via la décroissance des cercles d'excisions.Si certaines de ces approches ont déjà fait leurs preuves en recherche fondamentale, notamment l'Immunoscope® (Pannetier, C, J.